WB實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)

一、實(shí)驗(yàn)流程

1. 蛋白提取（組織 / 細(xì)胞）

2. BCA 蛋白定量

3. 制膠 + 上樣電泳

4. 轉(zhuǎn)膜（濕轉(zhuǎn) / 半干轉(zhuǎn)）

5. 封閉

6. 一抗孵育

7. 二抗孵育

8. ECL 化學(xué)發(fā)光顯影

9. 灰度分析（ImageJ）

二、詳細(xì)步驟

1. 蛋白提取

• 組織 / 細(xì)胞加入含蛋白酶抑制劑 + 磷酸酶抑制劑的 RIPA 裂解液

• 冰上裂解 30 min

• 4℃ 12000 rpm 離心 10 min，取上清

2. BCA 定量

• 按試劑盒做標(biāo)準(zhǔn)曲線

• 測(cè) OD 值，計(jì)算蛋白濃度

• 統(tǒng)一上樣量（通常 20–30 μg / 孔）

• 加 5×Loading buffer，煮沸 10 min 變性

3. 制膠與電泳

• 分離膠：8%–12%（根據(jù)分子量）

• 濃縮膠：5%

• 電泳：

• 濃縮膠：80 V

• 分離膠：120 V

• 至溴酚藍(lán)跑到底

4. 轉(zhuǎn)膜

• 常用 0.22 μm/0.45 μm PVDF 膜

• 甲醇活化膜 1 min

• 濕轉(zhuǎn)：250 mA 60–90 min

• 半干轉(zhuǎn)：15–25 min（看儀器）

5. 封閉

• 5% 脫脂牛奶或 BSA

• 室溫?fù)u床 1 h

6. 一抗孵育

• 按說(shuō)明書(shū)稀釋（1:500–1:2000 常見(jiàn)）

• 4℃ 搖床過(guò)夜

• TBST 洗膜 3×10 min

7. 二抗孵育

• 羊抗兔 / 羊抗鼠 HRP 二抗

• 1:5000–1:10000 稀釋

• 室溫 1 h

• TBST 洗膜 3×10 min

8. 顯影

• ECL 發(fā)光液 A:B 1:1 混合

• 均勻滴在膜上，化學(xué)發(fā)光儀成像

9. 分析

• ImageJ 測(cè)灰度值

• 目的蛋白 / 內(nèi)參（GAPDH/β-actin/Tubulin）

• 統(tǒng)計(jì)相對(duì)表達(dá)量

三、你課題常用指標(biāo)（直接對(duì)應(yīng)）

• 纖維化：α-SMA、Col1、TGF-β1、Smad2/3、p-Smad3

• 炎癥：TNF-α、IL-1β、NF-κB p65、p-p65、IκBα

• 凋亡：Bax、Bcl-2、Cleaved-Caspase3、Caspase3

• 氧化應(yīng)激：Nrf2、HO-1、SOD1

• 代謝 / 糖尿?。?span style="font-variant-numeric: normal; font-variant-east-asian: normal; font-variant-alternates: normal; font-size-adjust: none; font-language-override: normal; font-kerning: auto; font-optical-sizing: auto; font-feature-settings: normal; font-variation-settings: normal; font-variant-position: normal; font-variant-emoji: normal; font-stretch: normal; font-weight: 700; line-height: 24px; flex: 0 1 auto; flex-direction: row; justify-content: normal; align-items: normal; padding: 0px; margin: 0px; background-image: none; background-position: 0% 0%; background-size: auto; background-repeat: repeat; background-attachment: scroll; background-origin: padding-box; background-clip: border-box;">PPARγ、PI3K、Akt、p-Akt